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麦长管蚜翅型分化相关的生态学及microRNA水平的分子机理研究.pdf
蚜虫是研究翅二型性的理想模式昆虫，可结合遗传因素和环境因素变化研究翅分化机制。由于外界环境因子的影响，蚜虫在发育过程中呈现两种不同的生物型，有翅蚜和无翅蚜。这种表观形态的变化主要是由于受到环境因子的胁迫，通过选择性地表达基因从而达到了调控的作用，这属于典型的表观遗传学范畴。MICRORNAMIRNA作为重要的后转录水平调控因子，参与生物生长发育的各个生命过程，是表观遗传学的重要研究内容。随着近年来大量昆虫MIRNAS的鉴定，明确其在昆虫生长发育中的作用已成为新的研究热点，而且从MIRNA角度对昆虫翅发育的研究也取得了一些进展。因此，开展麦长管蚜翅型分化相关的生态学及MIRNA水平的分子机理方面的研究，为解析麦蚜的翅型分化机理奠定一定的理论基础。本研究利用体视显微镜、扫描电镜技术对麦长管蚜不同翅型不同龄期成若蚜的形态测量学和外部形态特征进行研究通过设定不同的外界因子，对麦长管蚜翅型分化的生态学进行研究运用高通量测序和QRTPCR等技术，对麦长管蚜翅型分化的MIRNA调控机理方面进行了研究。主要得到以下研究结果首先对麦长管蚜不同翅型不同龄期成若蚜的形态测量学和外部形态特征进行研究，结果表明麦长管蚜1、2龄若蚜外部形态无明显差别，触角均为5节3龄有翅若蚜中胸发达，可见初生翅芽，至成虫期发育为完整的翅3龄无翅若蚜中胸结构简单，未见翅芽，3龄至成蚜触角均为6节1龄若蚜尾片呈瘤状，着生2根刚毛2、3、4龄若蚜尾片呈圆锥形有翅成蚜尾片呈长锥形，无翅成蚜呈长舌状，2龄若蚜至成蚜尾片均着生6根以上刚毛1龄到3龄若蚜腹管的外部形态基本相似，呈圆柱状，4龄若蚜腹管端部开始膨大，近端部变细。有翅成蚜和无翅成蚜腹管基本无差异，与若蚜相比，近顶端表面均呈现多角形网状结构。通过设定不同的拥挤度、温度、母代效应、寄主营养等因素，观察对麦长管蚜翅型分化影响。结果表明初产若蚜的拥挤度越大，越有利于其形成有翅个体较高的温度和较低的温度处理条件下，均有利于麦长管蚜初龄若蚜有翅蚜的形成拥挤处理母代，对后代个体的翅型分化存在影响，处理不同翅型的母代对后代个体翅型分化也存在差异寄主营养不仅影响当代若蚜表型的变化，同样影响第二代的表型变化。通过构建麦长管蚜有翅成蚜和无翅成蚜的MIRNAS文库，利用高通量测序技术及生物信息学分析方法，测序结果中一共得到了146个保守的MIRNAS，152个新的MIRNAS，且34％以上的MIRNAS的长度分布在22NT，这符合典型的MIRNAS长度分布。采用数据归一化和差异检验方法（P值小于01、005以及001），筛选出52个表达差异显著MIRNAS，其中30个上调控的MIRNAS和22个下调控的MIRNAS。通过预测差异表达的MIRNAS的靶基因，利用基因本体论GO、KEGG信号通路分析，初步筛选出可能与麦长管蚜翅型分化相关的9个MIRNAS，包括7个保守的MIRNAS（LET7、MIR1_L1、MIR7、MIR277、MIR8、MR9A_R2和MIR315）和2个新的MIRNASPC5P113190_15和PC3P2743_844。通过QRTPCR技术分析9个MIRNAS在两翅型中的表达谱，结果表明9个MIRNAS在有翅成蚜中的表达量均高于无翅成蚜中的表达量，且有5个保守的MIRNASLET7、MIR1_L1、MIR7、MIR277和MIR8的表达量差异显著，推测这些MIRNAS可能在麦长管蚜的翅型发育中起重要调控作用。通过构建麦长管蚜翅型分化敏感期（有翅蚜和无翅蚜的伪胚胎、1龄和2龄）的MIRNAS文库，经过初步过滤筛选得到60％的CLEAN数据可用于后续的生物信息学分析。预测得到保守的PREMIRNA85个，UNIQUEMIRNA150个，新预测得到的新的PREMIRNA1050个，UNIQUEMIRNA1016个。通过差异检验方法对两两数据库进行差异比对，发现大量差异表达的MIRNAS。将预测得到的保守的MIRNAS与其他昆虫的MIRNAS进行保守性分析，表明其与邻近物种豌豆蚜ACYRTHOSIPHONPISUM保守性较高，其次是赤拟谷盗TRIBOLIUMCASTANEUM和家蚕BOMBYXMORI。通过QRTPCR技术对9个MIRNAS在两翅型不同龄期的表达谱进行分析，表明不同MIRNAS在麦长管蚜不同的翅型和不同发育阶段的相对表达量不同，进一步地揭示MIRNAS表达的特异性和时序性。选择两个前期预测得到的可能与麦长管蚜的翅型分化相关MIRNAS（MIR7和MIR277），根据MIRNA的成熟序列设计，人工合成双链小RNAMIRNAAGOMIR，通过模拟体内MIRNA，与靶基因相互配对，增强MIRNAS在体内的表达。用人工饲料将MIRNAAGOMIR稀释至300NM，将单头饲养三代的无翅成蚜初产24H内的若蚜，每10头放入含有相应MIRNAAGOMIR的饲蚜器中饲喂不同的时间。运用QRTPCR技术检测MIRNAAGOMIR的过表达效应，结果表明，与对照相比，随着饲喂时间的延长，目的基因MIR7和MIR277的表达量也随着增加。将饲喂不同时间的若蚜，单头单株接入到新鲜的盆栽麦株上。45天后，观察发现处理后的若蚜均能够正常生长，未观察到麦长管蚜若蚜翅型分化比例的变化。
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